Alteración en la barrera hematoencefálica generado por vesículas extracelulares pequeñas provenientes de placentas hipóxicas

Abstract

Preeclampsia (PE) es un síndrome hipertensivo del embarazo humano que se presenta después de las 20 semanas de gestación, y que se caracteriza por disfunción placentaria. Entre 6.2-7.4% de mujeres fallecen por complicaciones cerebrovasculares asociadas a PE como eclampsia, isquemia o hemorragia intracerebral. Además, cursan con disrupción de la barrera hematoencefálica (BHE), y edema cerebral vasogénico. La fisiopatología de estas complicaciones cerebrovasculares es desconocida. En este trabajo de tesis, hipotetizamos que vesículas extracelulares pequeñas (sEVs) provenientes de placentas hipóxicas son capaces de dañar la BHE, por un mecanismo que involucra reducción de la cantidad de claudina 5 (CLDN5). Esta última, es una proteína de unión estrecha entre células endoteliales, primordial para la estabilización en la función de la BHE. Para ello, se aislaron las sEVs desde explantes placentarios de embarazos normales, cultivados en normoxia (sEVs-Nor, 8% O2) o hipoxia (sEVs-Hyp, 1% O2) durante 18 horas, y se inyectaron a ratonas C57BL/6 no preñadas, para evaluar compromiso neurológico mediante escala rápida de coma y comportamiento murino (RMCBS), así como también análisis de disrupción de la BHE mediante ensayo con Evans blue (EB) sectorial. Además, se analizaron los efectos in vitro mediante evaluación de parámetros de BHE como resistencia eléctrica transendotelial (TEER) y permeabilidad celular a dextrano 70 kDa. Adicionalmente, se cuantificó la cantidad de CLDN5 tanto en cultivos celulares de endotelio cerebral de ratón y humano, como en tejido cerebral del modelo in vivo. Como resultados, se obtuvo que la inyección de sEVs-Hyp generan déficit neurológico en las ratonas desde las 3 horas, el cual es progresivo hasta las 24 horas post inyección. En estos animales, se evidenció una disrupción de la BHE mediante la cuantificación de extravasación de EB, principalmente en el área posterior del cerebro. Extravasación que concuerda con el modelo quirúrgico de preeclampsia caracterizado por la reducción de la perfusión uterina (RUPP). Las sEVs-Hyp tienen un alto contenido del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), lo cual se asocia con incremento del nivel de este factor detectado en suero de los animales inyectados con sEVs-Hyp. En forma importante, la inyección de sEVs-Hyp no genera cambios en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias en el suero a las 6 horas post-inyección. Además, en el modelo in vitro, encontramos que las sEVs son incorporadas rápidamente (30 minutos) en las células endoteliales cerebrales. Asociado a ello, se evidencia que las sEVs-Hyp disminuyen la TEER y aumentan la permeabilidad a dextrano 70 kDa. Estos resultados asociados con una disminución en los niveles de CLDN5 a las 6 horas post exposición a sEVs-Hyp. En experimentos paralelos, y como una aproximación traslacional, encontramos que sEVs provenientes de plasma de mujeres con PE también dañan la BHE in vitro, y reducen la expresión de CLND5, en la membrana de células endoteliales cerebrales humanas. Este efecto, requirió de la presencia integra de las sEVs. En conclusión, las sEVs-Hyp dañan la BHE tanto en modelos in vitro como in vivo, siendo esta disrupción de manera específica, en la zona posterior del cerebro. Además, este daño de la BHE se asocia con disminución en los niveles de proteína CLDN5. El mecanismo implicaría un aumento en el nivel de VEGF circulante, que pudiera dañar la BHE.