Reducida capacidad proangiogénica en ratones machos deficientes en el receptor de adenosina A2A

Abstract

Antecedentes: Adenosina es un nucleósido derivado del metabolismo del adenosin tri-fosfato que cumple múltiples funciones en el organismo, incluyendo control de la función y formación de vasos sanguíneos. Esta molécula actúa sobre una familia de receptores denominados A1, A2A, A2B y A3. Particularmente, el receptor A2A, tiene un rol estimulatorio de la formación de vasos sanguíneos (o angiogénesis), a través de la estimulación de proliferación, migración y maduración de células endoteliales. La importancia de este receptor en angiogénesis ha sido mostrada utilizando animales deficientes en el mismo, los cuales presentan una reducción en la capacidad angiogénica. Por otro lado, se conoce que hembras de distintas especies tienen una mayor capacidad angiogénica respecto a los machos. En el presente estudio proponemos que la deficiencia del receptor A2A de adenosina se asocia a menor capacidad angiogénica, la cual es más evidente en machos que en hembras. Objetivo: Determinar el papel del receptor de adenosina A2A como modulador del angiogénesis en ratones machos y hembras. Metodología: El presente estudio de tipo experimental, incluye dos modelos de estudio, uno in vitro y otro in vivo. Para el modelo in vitro, se aislaron cultivos primarios de células endoteliales de pulmón de animales controles o deficientes en el receptor A2A de adenosina (A2AAR-KO). Luego de la caracterización del cultivo primario mediante inmunoselección con CD31, las células fueron utilizadas para ensayos de western blot para determinar la presencia de los marcadores endoteliales CD34 y el receptor 2 del factor de crecimiento de endotelio vascular (KDR). Posteriormente, las células fueron utilizadas para extracción de RNA para determinar los niveles de RNA mensajero para los receptores A1, A2B y A3. Así como también se utilizaron las células para ensayos de proliferación, migración y capacidad de formación de tubos (angiogénesis in vitro) en ausencia o presencia de los agonistas no selectivos de los receptores de adenosina, NECA; o del agonista selectivo para el receptor A2A, CGS-21680. Todos los experimentos fueron realizados considerando el sexo de los animales desde los cuales fueron extraídas las células. Para los experimentos in vivo, animales control o A2AAR-KO fueron utilizados para ensayos de cicatrización de herida provocada en la zona dorsal del animal. Se realizó un seguimiento hasta los 10 días post-herida. En el día 4 post-herida se obtuvieron muestras de piel, las cuales fueron utilizadas para análisis histológico utilizado tinción de hematoxilina y eosina. Se realizó además análisis del flujo sanguíneo mediante laser Doppler. Resultados: Se encontró que las células CD31 positivas, mostraron un aumento significativo de KDR o de CD34 respecto a aquellas células no expuestas a selección por CD31 tanto en células de animales control como de A2AAR-KO. En hembras se encontró un aumento significativo en los niveles relativos de mRNA para el receptor A2B (1.8 veces, p<0.05) y el receptor A3 (2.7 veces, p<0.05) en A2AAR-KO respecto a su respectivo control (WT); mientras que en el receptor A1 no se evidencia cambios en los niveles relativos de mRNA en ambos grupos. Por otra parte, en machos se observó un aumento significativo en los niveles relativos de mRNA para los receptores A1 (2.1 veces, p<0.05) respecto a sus respectivos controles (WT). En el ensayo de proliferación celular se encontró que las hembras control mostraban una mayor sensibilidad al agonista no selectivo NECA que las hembras A2AAR-KO, o que los ratones machos control o A2AAR-KO, en al menos un orden de magnitud. No se observan cambios significativos en la logEC50 (10-6.4 M, 95%CI 10-7.39 a 10-5.54 M versus 10-6.1 M, 95%CI 10-6.59 a 10-5.65 M, respectivamente) entre células de hembras o machos control. Únicamente, las células endoteliales de animales control, hembras y machos, presentaron respuesta proliferativa mediada por CGS-21680. Además, en hembras control se mostró que tanto NECA como CGS-21680 incrementaron significativamente la migración celular respecto a la condición basal; situación que no se observó en su contraparte A2AAR-KO. Es más, en este último grupo, la respuesta a CGS-21680 fue significativamente menor que la observada en los ratones control. Para el caso de los machos, se encontró que únicamente CGS-21680 fue capaz de provocar un aumento significativo (1.3 veces, P<0.05) en la migración celular en ratones control. En ratones A2AAR-KO, ni NECA o CGS-21680 generaron cambios significativos respecto a la condición basal. Sin embargo, a diferencia de lo observado en hembras, los machos A2AAR-KO tuvieron una menor respuesta migratoria en todas las condiciones experimentales. Respecto a los ensayos de diferenciación endotelio o angiogénesis in vitro, mosque que las células de hembras o machos control incrementaron significativamente en presencia de NECA o CGS-21680, un efecto que no fue observado en células de ratones A2AAR-KO. Los resultados in vivo mostraron que los machos A2AAR-KO tuvieron una herida más grande que sus respectivos controles (0.63  0.09 vs 0.27  0.01 mm, respectivamente, P=0.05). Mientras que, en hembras, las diferencias no fueron estadísticamente significativas entre ratones A2AAR-KO y sus controles a los 10 días de seguimiento. Además, se encontró que los machos A2AAR-KO tuvieron una dermis más gruesa (1.3 veces, P<0.05), pero una epidermis más delgada (-15%) que las hembras A2AAR-KO. Finalmente, los resultados muestran que el flujo sanguíneo fue mayor en los animales A2AAR-KO en hembras y machos, siendo en estos últimos estadísticamente significativo respecto a su respectivo control (P=0.01). De forma interesante, los resultados también muestran que el flujo sanguíneo en hembras A2AAR-KO fue constante, similar a lo encontrado en ratones hembra control. Sin embargo, en el ratón macho A2AAR-KO el flujo fue intermitente mostrando una amplia variabilidad en las mediciones. Conclusión: La condición genotípica de deficiencia del receptor A2A de adenosina genera una adaptación pro angiogénica tanto en hembras como en machos, dándoles una ventaja a las hembras respecto a los machos, tanto en ensayos in vitro (migración y diferenciación endotelial (tubos) como la respuesta in vivo (cicatrización y fluyo sanguíneo).