Regulación de la expresión del factor de crecimiento de endotelio vascular por el A2AAR de adenosina

Abstract

Antecedentes: Estudios farmacológicos sugieren que la activación del receptor de adenosina A2A (A2AAR) vía generación de óxido nítrico (NO) aumenta la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) provenientes de embarazos normales o con pre-eclampsia. Por otro lado, el factor inducido por hipoxia 1 alfa (HIF-1α) regula la expresión de VEGF y además es sensible a cambios en los niveles de NO intracelular. Objetivos: Comprobar si la presencia funcional del A2AAR es necesaria para regular expresión de VEGF en células provenientes de embarazos normales y pre-eclámpticos; e, investigar si el aumento de la expresión de VEGF mediada por A2AAR involucra la participación de HIF-1α. Metodología: Cultivos primarios de HUVEC, así como de células endoteliales de la microcirculación placentaria (hPMEC) de embarazos normales (n=10) y pre-eclámpticos (n=8) fueron utilizados en este estudio. Además, en experimentos puntuales de hipoxia (i.e., 2% oxígeno, como modelo de pre-eclampsia) se utilizó una línea celular de HUVEC. Las células fueron incubadas (12 o 24 h) con el agonista selectivo del A2AAR, CGS-21680 (10-8M) en ensayos de pérdida y ganancia de la expresión funcional del A2AAR, para posteriormente medir los niveles de mRNA de VEGF por PCR semicuantitativo, proliferación celular y ensayos de angiogénesis en matrigel. En experimentos paralelos, el donador de óxido nítrico, SNAP (10-9M) fue co-incubado con CGS-21680 en ensayos de represión de la expresión de A2AAR. Estudios de translocación de HIF-1α fueron realizados en células expuestas a CGS-21680, utilizando histona 3 como marcador de extracción nuclear. Resultados: La estimulación con CGS-21680 (24 h) aumenta la proliferación celular en forma dosis respuesta (LogEC50 10-9.6 M), la cual fue inhibida por su antagonista selectivo SCH-58261. Además, similar a CGS-21680, SNAP aumentó la proliferación celular en forma dosis respuesta (LogEC50 10-9.2 M). Posteriormente, HUVEC expuestas a un RNA de interferencia (siRNA) para A2AAR, mostraron una reducción en el nivel de mRNA (94%) y de proteína (83%) para A2AAR respecto a la condición control sin siRNA; lo cual se asoció a una significativa reducción en la respuesta a CGS-21680, estimada por los niveles de AMP cíclico intracelular (AMPc), y nitritos, (i.e., metabolitos NO), así como por una reducida capacidad de formación de tubos en matrigel, sin afectar la sobrevida celular. En estas condiciones experimentales, se encontró que el donador de NO, SNAP, recuperó parcialmente la proliferación celular y la capacidad de formación de tubos de las células provenientes de embarazos normales expuestas a siRNA para A2AAR. En otra serie de experimentos se encontró que CGS-21680 incrementoo significativamente (~1.5 veces) el nivel de mRNA para VEGF en células de embarazos normales, pero no así, en HUVEC de pre-eclampsia. Adicionalmente, en comparación con células no transfectadas, la transfección con 2 siRNA para A2AAR generó una disminución (~30%) del nivel de mRNA para VEGF en embarazo normal y preeclampsia, un efecto que fue revertido mediante la co-incubación con SNAP, únicamente en células de embarazos normales. Por otro lado, en una línea celular de HUVEC en la cual se realizaron ensayos de ganancia y pérdida de expresión del A2AAR mediante la utilización del vector CVM-flag A2A y del siRNA A2A, respectivamente; se encontró que CGS-21680 no fue capaz de aumentar significativamente los niveles de mRNA para VEGF tanto en condición normoxia como hipoxia. Sin embargo, la represión del A2AAR redujo significativamente (32%) los niveles de mRNA para VEGF en condición normoxia; no así en hipoxia, en donde hubo una reducción parcial del 18% en relación al control. Paradójicamente, la sobre-expresión del A2AAR también redujo el nivel de VEGF tanto en normoxia (62%, p<0.05) como en hipoxia (56%, p=NS). Además, se mostró la presencia de la vía A2A-NO-VEGF en hPMEC de embarazos normales y pre-eclámpticos. Así, en estas células, CGS-21680 aumentó la proliferación celular en forma dosis respuestas mostrando una logEC50 de 10-8.7 M. CGS-21680 (10-8M x 12 h) aumentó el nivel de proteína VEGF tanto en células de embarazos normales (1.5 veces) como pre-eclámpticas (1.2 veces). Este aumento, fue bloqueado por el antagonista del A2AAR, ZM-241385 (10-5 M) y por el inhibidor de la síntesis de NO, L-NAME, en células de ambas condiciones estudiadas. Adicionalmente, ZM-241385 o L-NAME, en forma independiente, redujeron (40 y 80%, respectivamente) la abundancia de proteína VEGF en células de embarazos normales. Por su parte en pre-eclampsia, también se evidenció una reducción con estas dos moléculas alcanzando 50 y 15% de reducción, respectivamente, en relación a la condición basal sin tratamiento. Finalmente, los estudios de translocación mostraron que CGS-21680 indujo un aumento significativo en el nivel de proteína HIF-1α en la fase nuclear en células de embarazos normales, pero no en aquellas provenientes de pre-eclampsia. Conclusiones: La presencia de A2AAR es necesaria para inducir la expresión de VEGF, por una vía que involucraría óxido nítrico y translocación del HIF-1α al núcleo. La vía A2A-NO-VEGF estaría presente en forma transversal en endotelio de la micro y la macrocirculación ya sea de embarazos normales o pre-eclámpticos. Sin embargo, en HUVEC de pre-eclampsia, es posible que la señalización vía NO esté alterada. La sobre-expresión de A2AAR desencadena un efecto compensatorio de limitación de la expresión de VEGF.